pET載體系統(tǒng)是用于在大腸桿菌中表達重組蛋白的功能強大且廣泛使用的系統(tǒng)，載體上的噬菌體T7強啟動子能夠調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。細胞內(nèi)存在T7 RNA聚合酶時，重組蛋白的表達被激活。當處于完全誘導狀態(tài)時，幾乎所有細胞資源都會致力于表達目的蛋白，僅需幾個小時的誘導，目的蛋白的表達量就可以占細胞總蛋白的一半。

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首先，在缺乏T7 RNA聚合酶基因的宿主菌中，將目的基因克隆到pET載體上，這樣可以以防止重組毒性蛋白的表達引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定性。之后，重組蛋白可以通過兩種方式表達：一種是將攜帶T7 RNA聚合酶基因的噬菌體（例如λCE6噬菌體）感染宿主菌；更常見的另外一種是將pET質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到由LacUV5啟動子驅(qū)動T7 RNA聚合酶基因表達的細菌宿主菌中，通過向菌液中加入乳糖類似物IPTG來誘導T7聚合酶的表達。

pET載體在宿主大腸桿菌中以低拷貝質(zhì)粒存在，可減少誘導前的泄漏表達。該載體利用T7lac啟動子系統(tǒng)對基因表達進行嚴格調(diào)控。T7啟動子可以被T7 RNA聚合酶作用以驅(qū)動目的基因的高水平表達。但在T7啟動子正下游有一個lac操縱子（LacO）序列，它可以與lac阻遏蛋白（LacI）蛋白作用以阻斷T7啟動子的轉(zhuǎn)錄。pET載體上攜帶有LacI的天然啟動子和編碼序列。LacI蛋白可以作用于宿主細胞中的LacUV5啟動子，以抑制宿主菌合成T7 RNA聚合酶；也作用于pET載體上的T7lac啟動子，以阻斷抑制由于T7 RNA polymerase的泄漏表達引起的目的基因的轉(zhuǎn)錄。IPTG可以阻斷LacI的抑制作用，從而誘導T7 RNA聚合酶和目的基因的表達。

盡管pET是高水平重組蛋白表達系統(tǒng)，但也可通過減少IPTG的用量來調(diào)控降低表達水平，這對于表達可溶性低的蛋白是非常有利的。另外，當T7 RNA聚合酶不存在時，目的基因可以維持在轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)。

所有定制的pET載體都會克隆在缺乏T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌中（如Stbl3），以最大程度地降低質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。對于重組蛋白生產(chǎn)，我們推薦將載體轉(zhuǎn)移到BL21（DE3）或HMS174（DE3）宿主菌中，這些菌株的基因組攜帶了由LacUV5啟動子驅(qū)動的T7 RNA聚合酶基因。如果目的基因表達毒性蛋白，則建議使用攜帶pLysS或pLysE質(zhì)粒的宿主菌，這些質(zhì)粒通過產(chǎn)生T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶抑制劑）來抑制目的基因的本底表達。

表達水平高：T7轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控系統(tǒng)能使目的蛋白高水平表達。通常情況下，重組蛋白的表達量可達到總蛋白量的50％。

表達嚴謹：在沒有添加IPTG的情況下，目的基因的表達通常會被強烈抑制。在大多數(shù)宿主菌株中，目的基因的這種“關(guān)閉”狀態(tài)非常穩(wěn)定，且適用于大部分基因。

宿主要求：pET載體應保存在缺乏T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌中，須轉(zhuǎn)移至攜帶T7 RNA聚合酶基因的宿主菌中誘導目的蛋白的表達。

潛在泄漏表達：在某些表達宿主菌株中，即使沒有IPTG，T7 RNA聚合酶也會低水平表達，使得某些目的基因泄露表達從而引起細菌毒性反應。

T7 promoter: Drives high-level transcription of the gene of interest when T7 RNA polymerase is present. When placed immediately upstream of a LacO element, the entire cassette is known as the T7lac promoter.

LacO: Binding site for LacI. This element inhibits activity of the T7 promoter when LacI protein is present, preventing leaky expression of the gene of interest.

RBS: The ribosome-binding site and translation initiation element from T7 bacteriophage. This allows for efficient production of the protein of interest.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

T7 terminator: Signal sequence to terminate the transcript made from the gene of interest, preventing run-on transcription.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin as well as the Rop gene exist in low copy numbers in E. coli.

Rop: Repressor of primer. It encodes a small protein that regulates plasmid copy number. The presence of the Rop protein, in combination of pBR322 origin of replication on the plasmid, results in low copy numbers of the plasmid.

LacI: The E. coli natural promoter and coding sequence for the lac repressor. In the absence of induction of the system (i.e. without IPTG), the LacI protein represses transcription of the gene of interest from the T7lac promoter, as well as transcription of T7 RNA polymerase from the LacUV5 promoter in host strains used for recombinant protein production.